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正确认识双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的相关知识

作者: 来源: 日期:2016/12/30 9:12:01 人气:19

为大家介绍关于双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的相关知识是如何按等电点和分子量对蛋白质进行分离,同时它具有很高的分辨率,现在已经成为蛋白质组研究中的核心技术之一。将会介绍双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的原理、检测步骤进行介绍,并对其存在问题与发展进行简要介绍。

    双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术作为一种分离和检测复杂生物体系中蛋白质的方法由OF' ar-rell等于1975年首先提出。该技术是目前常用的并且是唯一的一种能够连续在同一块胶上分离数千种蛋白质的方法,被广泛应用于生物学研究的各个方面。2D-PAGE技术联合质谱技术和生物信息学技术,很大程度上提高了蛋白质分析的分辨率和精确度,将蛋白质组研究提高到一个新的水平。

    1 2D-PAGE技术原理

    2D-PAGE技术由任意两个单向聚丙烯酰胺凝胶电泳组合而成的,在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。目前,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳大都为第一向为等电聚焦,将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点,通过电荷分离蛋白质;第二向为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过分子量分离蛋白质。样品经过电荷和质量两次分离后,所得蛋白质二维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质。

    2 2D-PAGE技术步骤

    2D-PAGE技术主要包括样品制备、双向电泳、凝胶的染色以及图谱分析等步骤。

    2.1 样品制备 

    样品制备主要包括组织或细胞的破碎、失活或者去除干扰物质、蛋白质增溶溶解等步骤,以充分破坏蛋白质之间的相互作用,最大限度地提取生物体细胞、组织或器官的蛋白质,并保持其较好的溶解性,除去其中的非蛋白质组分,与此同时,还要尽量避免对蛋白质产生化学修饰。但到目前还没有一种能广泛用于各种生物样品制备的方法。就目前研究状况而言,从双向电泳胶上分辨出来的蛋白质分离得还是不充分的,特别是疏水蛋白质。

    为简化样品复杂度,富集特定的蛋白如低丰度蛋白或膜蛋白,样品制备中现常采用预分级处理法,如顺序抽提法、色谱法、激光捕获微切割技术、预聚焦处理、亚细胞分类法及选择性沉淀法等。对于不同的样品性质及研究目的,其制备方法也不尽相同。根据样品的不同性质,可选择具有单一增溶作用的溶液,也可用含多种分离液剂、去垢剂和还原剂的复杂混合液进行处理。用于样品处理的缓冲液必须在低离子强度的基础上,既能保持蛋白质的天然电荷,又能维持其溶解性。因此,绝大多数样品往往都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的

    2.2 双向电泳 

    按现在通行的实验方法,双向电泳可以分为三步:一向等电聚焦电泳、平衡、二向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

    2.2. 1 等电聚焦电泳

   2D-PAGE的一向技术有三种方法:①等电聚焦以技术为基础。第一向应用载体两性电解质,在管胶内建立pH梯度。但随着聚焦时间的延长, pH梯度不稳,易产生阴极漂移。②非平衡pH梯度凝胶电泳用于分离碱性蛋白(pH>7.0)。如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失。因此,在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成,但很难控制。③固相pH梯度等电聚焦电泳发展于20世纪80年代早期。由于固相pH梯度的出现解决了pH梯度不稳的问题。PG通过共价偶联于聚丙烯酰胺产生固定的pH梯度,克服了IEF的缺点,从而达到高度的重复性。目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线,范围或宽或窄的pH梯度。pH3~pH5、pH6~pH11与pH4~pH7的IPG梯度凝胶联合使用可形成蛋白质组重叠群从而有效分离蛋白质。

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